Le Tartarughe tornano per salvare la città da una pericolosa minaccia.
Le riprese principali del film sono iniziate il 27 aprile 2015 a New York. È stato distribuito il 3 giugno 2016 in 3D, RealD 3D e IMAX 3D da Paramount Pictures. Sebbene la critica abbia considerato il film un miglioramento marginale rispetto al suo predecessore, ha ricevuto recensioni contrastanti e non ha avuto successo finanziario, incassando 245 milioni di dollari a fronte di un budget di 135 milioni di dollari, tanto che il progetto di un terzo film è stato abbandonato. Nel 2018 è stato annunciato un reboot animato della serie, la cui uscita è prevista per l'11 agosto 2023.
Un anno dopo aver fermato Shredder, le Teenage Mutant Ninja Turtles vengono informate da April O'Neil che lo scienziato Baxter Stockman lavora per Shredder e intende farlo uscire di prigione. Mentre Shredder viene trasferito tra le prigioni insieme a Bebop e Rocksteady dall'agente di custodia Casey Jones, il Clan del Piede attacca il loro convoglio. Nonostante l'interferenza delle tartarughe, Shredder fugge quando Stockman utilizza un dispositivo di teletrasporto. Shredder viene dirottato durante il teletrasporto, finisce in un'altra dimensione e incontra il signore della guerra alieno Krang, che gli rivela i suoi piani per invadere la Terra. Dà a Shredder un composto mutageno in cambio del ritrovamento di tre componenti di una macchina che Krang inviò sulla Terra molto tempo fa e che, una volta unita, aprirà un portale verso la sua dimensione: Shredder e Stockman hanno il primo pezzo. Casey racconta al capo della polizia di New York Rebecca Vincent cosa è successo a Shredder, ma viene accolto con incredulità e decide di andare per conto suo.
Shredder recluta Bebop e Rocksteady e Stockman usa il mutagene di Krang per trasformarli rispettivamente in un facocero umanoide e in un rinoceronte. April assiste alla loro trasformazione e ruba la fiala di mutagene rimasta dal laboratorio TCRI. Inseguita dal Piede, viene salvata da Casey, che in seguito incontra le tartarughe, ma la fiala viene presa in custodia dalla polizia. Nella tana, Donatello deduce che il mutagene potrebbe essere usato per trasformare le tartarughe in umani, ma Leonardo si rifiuta e ordina a Donatello di mantenere il segreto con gli altri. Tuttavia, Michelangelo ascolta e lo dice a Raffaello, il che fa infuriare Raffaello e porta a una feroce discussione tra lui e Leo. Raphael recluta Mikey, April, Casey e Vern Fenwick per introdursi nel quartier generale della polizia di New York e recuperare il mutagene, ma il Piede arriva prima di loro. Nella battaglia che segue, l'esistenza delle tartarughe viene rivelata alla polizia, che inizia una caccia all'uomo e April e Casey vengono arrestati mentre aiutano i fratelli a fuggire con il mutagene.
Dopo aver recuperato il secondo componente della macchina, Bebop e Rocksteady si recano nelle foreste pluviali di Manaus, in Brasile, per trovare il componente finale. Le tartarughe li seguono e salgono a bordo del jet di Bebop e Rocksteady a mezz'aria. Nella battaglia che ne consegue, il jet viene danneggiato gravemente dopo che Rocksteady spara con un lanciagranate Mark 19 montato su un carro armato e si schianta in un fiume, anche se alla fine Bebop e Rocksteady riescono a fuggire con il componente. Shredder e Stockman completano il dispositivo e aprono un portale verso la dimensione di Krang attraverso il quale inizia a emergere la sua macchina da guerra, il Technodrome. Shredder tradisce Stockman e i suoi uomini lo portano al loro quartier generale a Tokyo. Quando entra nel Tecnodromo, anche Krang tradisce Shredder, congelandolo e rinchiudendolo con la sua collezione di altri nemici sconfitti.
Non riuscendo a raggiungere il Tecnodromo mentre la polizia li insegue, le tartarughe decidono di assumere il mutageno per diventare umane e combattere apertamente. Mentre Leonardo è d'accordo, Raph manda in frantumi la fiala. Su richiesta di April, Vern recupera il filmato di sicurezza di una telecamera nascosta del TCRI che prova la collaborazione tra Stockman e Shredder e assicura il rilascio di April e Casey. April organizza un incontro tra le tartarughe e Vincent e la convince che non sono nemici. Con l'aiuto della polizia, le tartarughe riescono a saltare dal Chrysler Building e ad affrontare Krang a bordo del Tecnodromo ancora in fase di assemblaggio. Krang viene sconfitto quando Donatello manda in corto circuito il suo corpo robotico. April, Casey e Vern fanno irruzione nella struttura del Clan del Piede, sconfiggono Bebop, Rocksteady e il luogotenente di Shredder, Karai, e prendono il controllo del dispositivo. Le tartarughe riescono a scagliare il radiofaro della nave attraverso il portale, portando con sé Krang e il resto del Technodrome, mentre April, Casey e Vern chiudono il portale.
Bebop e Rocksteady sono di nuovo in custodia, mentre Stockman rimane in libertà. Le tartarughe vengono premiate da Vincent e dalla polizia di New York insieme ad April, Casey e Vern. Vincent si offre di presentare le tartarughe al pubblico, ma le tartarughe scelgono di mantenere il segreto sulla loro esistenza, continuando ad aiutare come hanno sempre fatto. In cima alla Statua della Libertà, le tartarughe festeggiano la loro vittoria su Krang, ormai sconfitto.